研究背景
益生菌通過(guò)維持腸道微生物群穩(wěn)定和緩解疾病癥狀，為宿主帶來(lái)健康益處。羅伊氏粘液乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri）是一種典型益生菌，具有多種益生特性，推測(cè)其基因組中存在許多重要功能基因，因此有必要在基因組水平上進(jìn)行分析。Kong等通過(guò)全基因組測(cè)序證明豬源羅伊氏粘液乳桿菌TPC32具有治療腸道炎癥的生物學(xué)功能和治療潛力。Morita等通過(guò)羅伊氏粘液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的比較基因組分析，揭示羅伊氏粘液乳桿菌含有產(chǎn)生羅伊氏素和鈷胺素的基因簇，是一種適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果，有助于羅伊氏粘液乳桿菌益生菌特性的產(chǎn)生。Saulnier等通過(guò)比較不同來(lái)源（母乳、胃腸道和口腔）的羅伊氏粘液乳桿菌，表明功能基因的表達(dá)及其代謝途徑的激活可能促進(jìn)菌株在不同的環(huán)境中生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，基因組測(cè)序和比較基因組分析有助于全面表征菌株的遺傳特征，揭示不同物種的進(jìn)化關(guān)系和基因差異。
方法
1.全基因組測(cè)序與分析
提取菌株AR673的基因組DNA，測(cè)量提取的總DNA的數(shù)量和質(zhì)量。采用高質(zhì)量DNA構(gòu)建DNA文庫(kù)，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序、三代序列組裝，最終得到完整的染色體序列。生物信息學(xué)分析：對(duì)基因組中的tRNA和rRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)、NR數(shù)據(jù)庫(kù)、GO、Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)、COG、和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)6大數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行比對(duì)，對(duì)預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行功能標(biāo)注。通過(guò)Circos軟件繪制單個(gè)樣本基因組圈圖。以乳酸菌的16S rRNA基因序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
2.比較基因組分析
采用BLASTN對(duì)乳酸菌菌株進(jìn)行全基因組比較。采用CD-HIT相似蛋白快速聚類(lèi)軟件對(duì)核心基因和特異基因進(jìn)行分析。利用Hcluster_sg軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行基因家族聚類(lèi)處理，進(jìn)行37個(gè)基因組同源性比較。采用整合原核生物基因組和泛基因組分析（IPGA）平臺(tái)進(jìn)行平均核苷酸一致性（ANI）分析。利用碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)分析37株菌的碳水化合物活性酶，使用在線云平臺(tái)chiplot繪制CAZymes熱圖。采用antismash軟件對(duì)菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成基因簇進(jìn)行比較。
結(jié)果
AR673全基因組信息分析結(jié)果是，COG（圖3）和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分別注釋到1 656個(gè)（圖3）和1 226個(gè)基因（圖4）。其中，功能注釋基因以代謝、遺傳信息進(jìn)程和環(huán)境信息進(jìn)程通路中注釋的基因最多。環(huán)境信息進(jìn)程通路中只有2類(lèi)，基因數(shù)量最多的是膜轉(zhuǎn)運(yùn)；遺傳信息進(jìn)程通路中功能基因主要定位于翻譯；代謝通路中基因數(shù)量最多的為碳水化合物代謝、輔因子和維生素的代謝和氨基酸代謝通路。AR673具有高達(dá)112個(gè)基因的碳水化合物代謝注釋量，表明該菌株可能在糖類(lèi)分解和代謝功能中具有菌株優(yōu)勢(shì)?？箲?yīng)力分析發(fā)現(xiàn)羅伊氏粘液乳桿菌AR673含有一系列編碼溫度、pH值、膽鹽、滲透壓、氧化等應(yīng)激蛋白的基因（表2）。由此推測(cè)AR673可能具有耐酸、溫度脅迫、膽鹽脅迫、抗氧化的等特性，可能預(yù)示AR673在發(fā)酵工業(yè)中具有優(yōu)勢(shì)。
泛基因組分析結(jié)果顯示，37株羅伊氏粘液乳桿菌的泛基因組呈開(kāi)放型狀態(tài)，數(shù)量為5 066個(gè)，可分為1 190個(gè)核心基因組（23.49%）以及1 167個(gè)菌株特異性基因（圖6）。37株菌株間菌株特異基因數(shù)量差異較大，菌株特異性基因的數(shù)量從僅在19-E-6、19-E-3、VHProbi E18、VHProbi M07中發(fā)現(xiàn)的0個(gè)基因簇到LL17所特有的173個(gè)基因簇不等，可能與不同寄主生存環(huán)境的差異有關(guān)。
羅伊氏粘液乳桿菌的泛基因組的擬合曲線（圖7），隨著菌株數(shù)量的增加呈上升趨勢(shì)，這可能是由于其在自然界中分布廣泛，與外界各種遺傳物質(zhì)發(fā)生交換，說(shuō)明該物種有較高的遺傳多樣性，且具有對(duì)周?chē)h(huán)境和宿主的適應(yīng)性。其核心基因的數(shù)量隨菌株數(shù)量增加逐漸趨于穩(wěn)定，說(shuō)明該物種的穩(wěn)定性較高。37株羅伊氏粘液乳桿菌的特異性基因數(shù)量有差異可能與其生長(zhǎng)環(huán)境和代謝特性有關(guān)。
碳水化合物活性酶分析結(jié)果顯示，羅伊氏粘液乳桿菌可注釋到的CAZymes為4類(lèi)：GH、GT、AA和CMB（圖8）。最普遍的CAZy分類(lèi)為GH、GT。說(shuō)明羅伊氏粘液乳桿菌有較高的糖、纖維素的合成能力，豐富的GHs表明其對(duì)宿主來(lái)源的碳水化合物的利用能力。
通過(guò)次級(jí)代謝產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)不同的羅伊氏粘液乳桿菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇不同。主要預(yù)測(cè)到細(xì)菌素（Bacteriocin）、聚酮合酶（PKS）、和非核糖體肽合酶（NRPS）等次級(jí)代謝產(chǎn)物。其中，羅伊氏粘液乳桿菌Byun-re-01、I49、LL17、SKKU_OGDONS_0、FN041均含有細(xì)菌素合成基因簇，羅伊氏粘液乳桿菌FN041含有2個(gè)細(xì)菌素合成基因簇。羅伊氏粘液乳桿菌YLR001含有1個(gè)非核糖體肽合酶（NRPS）產(chǎn)生基因簇。37株菌均含有一個(gè)III型聚酮化合物合酶合成基因簇，能合成聚酮類(lèi)化合物，可用于研制抗生素、抗菌劑等。次級(jí)代謝產(chǎn)物的分析為解釋羅伊氏粘液乳桿菌的抗菌活性提供了更有效的依據(jù)。
結(jié)論
本研究以羅伊氏粘液乳桿菌AR673為例，通過(guò)全基因組測(cè)序和比較基因組分析了羅伊氏粘液乳桿菌的基因組特征、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化和可能存在的益生功能。COG和KEGG結(jié)果表明AR673可能具有巨大的翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生的潛力；在糖類(lèi)分解和代謝功能中具有菌株優(yōu)勢(shì)。對(duì)抗應(yīng)力情況的研究顯示，AR673可能具有耐酸、溫度脅迫、膽鹽、氧脅迫的特性。37株羅伊氏粘液乳桿菌基因組比較分析顯示，羅伊氏粘液乳桿菌泛基因組呈開(kāi)放型。次級(jí)代謝系統(tǒng)比較發(fā)現(xiàn)，37株菌共注釋到4類(lèi)CAZymes，3種次級(jí)代謝產(chǎn)物。碳水化合物酶主要注釋到GH、GT家族，次級(jí)代謝產(chǎn)物中聚酮合酶、細(xì)菌素占多數(shù)。綜上所述，羅伊氏粘液乳桿菌AR673是一株具有多種益生功能的菌株，為后續(xù)羅伊氏粘液乳桿菌在食品工業(yè)中的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了參考。
原文鏈接：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=mg_qcPBBapmbg71xWSJLk3UbkIfV_BmHxGA7Ws3GbKxirTXNrsNGfTvy3TA29EPYcgq0UZ8z70EfkSgGtaOWC-DKIs6LzwTXB7sIpPnaxlpggz7SEPLY74ZO_fpVZmnlmY8Q71atvvGqMcz0GF1n0aeHddLSiBj8D3g3qEGqKEiP9VhlME2ITQ==&uniplatform=NZKPT&language=CHS
